Γενετικοί αρχιτέκτονες ανατρέπουν τις στροφές του DNA
Όταν οι επιστήμονες ολοκλήρωσαν την αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος το 2003, πολλοί ερευνητές εστίασαν την προσοχή τους στην αποκωδικοποίηση των μακριών χορδών των As, Ts, Gs και Cs ως τον τρόπο κατανόησης των μυστηρίων της ανθρώπινης γενετικής. Το γονιδίωμα, ωστόσο, δεν εμφανίζεται στη φύση ως μια απλή μακρά σειρά γραμμάτων. Ξεδιπλωμένο, το γονιδίωμα εκτείνεται για σχεδόν δύο μέτρα, ωστόσο αναδιπλώνεται σε πηνία και βρόχους για να χωρέσει μέσα σε έναν πυρήνα με διάμετρο μικρότερη από 10 μικρά.
Τα τελευταία χρόνια, οι ερευνητές έχουν αρχίσει να κατανοούν πόσο σημαντική είναι πραγματικά αυτή η τρισδιάστατη γενετική αρχιτεκτονική. Όπως η μόνη προσβάσιμη πληροφορία σε ένα βιβλίο είναι αυτή που βρίσκεται στην ανοιχτή σελίδα μπροστά σας, οι οδηγίες του γονιδιώματος μπορούν να διαβαστούν από το κύτταρο μόνο όταν αυτές οι οδηγίες δεν είναι κρυμμένες σε βαθιές πτυχές. Αλλά οι ερευνητές δεν καταλαβαίνουν πώς το κύτταρο διπλώνει το DNA με τέτοιο τρόπο ώστε να μπορούν να διαβαστούν τα σημαντικά κομμάτια.
Νωρίτερα φέτος, δύο ανεξάρτητες ομάδες ερευνητών έκαναν ένα μεγάλο βήμα προς την αποκωδικοποίηση των μυστηρίων της αναδίπλωσης του DNA. Και οι δύο ομάδες χρησιμοποίησαν το ισχυρό νέο εργαλείο επεξεργασίας γονιδίων γνωστό ως CRISPR για να ξετυλίξουν ένα σφιχτά τυλιγμένο κομμάτι DNA. Η εργασία τους θα μπορούσε να βοηθήσει τους επιστήμονες να εντοπίσουν μερικούς από τους βασικούς κανόνες πίσω από το πώς και γιατί το γονιδίωμα σχηματίζει την τρισδιάστατη δομή του. Αποκαλύπτει επίσης ότι η παρουσία μικρών αλληλουχιών DNA μπορεί να οδηγήσει σε τεράστιες αλλαγές στον τρόπο οργάνωσης του γονιδιώματος.
Η νέα έρευνα ξεκίνησε ως μια προσπάθεια κατανόησης ενός μυστηρίου του χρωμοσώματος Χ. Τα περισσότερα αρσενικά θηλαστικά έχουν ένα Χ και ένα Υ χρωμόσωμα, ενώ τα περισσότερα θηλυκά έχουν δύο Χ. Αυτό παρουσιάζει ένα πιθανό πρόβλημα για τον κυτταρικό μηχανισμό μιας γυναίκας. Εάν και τα δύο X παραμένουν ενεργά, θα ενεργοποιηθεί ο διπλάσιος αριθμός των γονιδίων του χρωμοσώματος Χ. Αυτό θα οδηγήσει σε μια σειρά από αναπτυξιακές δυσκολίες, που συχνά καταλήγουν στο θάνατο του εμβρύου αμέσως μετά τη γονιμοποίηση.
Για να αποφευχθεί αυτό το σενάριο, ένα αντίγραφο του χρωμοσώματος Χ απενεργοποιείται χρησιμοποιώντας ένα γονίδιο που ονομάζεται Xist . Το ανενεργό χρωμόσωμα Χ, γνωστό ως σώμα Barr, είναι μικρό. Τυλίγεται και κρύβει σχεδόν όλα τα γονίδιά του από τον κυτταρικό μηχανισμό που μετατρέπει το DNA σε RNA και πρωτεΐνες.
«Η αδρανοποίηση του Χ είναι μια κρίσιμη διαδικασία στην ανάπτυξη της γυναίκας», είπε ο Μπράιαν Τσάντγουικ, βιολόγος στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Φλόριντα. "Η μόνη διαφορά μεταξύ των δύο X είναι το πώς είναι συσκευασμένα."
Ο Τσάντγουικ έχει περάσει ολόκληρη την καριέρα του προσπαθώντας να καταλάβει πώς το σώμα αδρανοποιεί ένα αντίγραφο του χρωμοσώματος Χ. Η εργασία του Chadwick στα σώματα Barr μηδενίστηκε σε μια αλληλουχία DNA που ονομάζεται DXZ4 ως δυνητικά κλειδί για την αναδίπλωση που απενεργοποιεί τα περισσότερα από τα γονίδια σε ένα αντίγραφο του χρωμοσώματος Χ. Όλα τα θηλαστικά που εξέτασε η ομάδα του με ένα ανενεργό χρωμόσωμα Χ είχαν αυτές τις αλληλουχίες.
Πώς όμως ο Chadwick έλεγξε αν ο DXZ4 ήταν πραγματικά ο κύριος του origami του χρωμοσώματος Χ; Μια σημαντική ένδειξη εμφανίστηκε το 2014, σε μια εργασία που είχε ξεκινήσει πάνω από δύο δεκαετίες πριν.
Οι πρώτες συνδέσεις
Ως διδακτορική φοιτήτρια στο εργαστήριο του Mark Seyfred στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt στις αρχές της δεκαετίας του 1990, η Katherine Cullen ήθελε να κατανοήσει μια πρωτεΐνη που ονομάζεται προλακτίνη, η οποία επιτρέπει στα θηλυκά θηλαστικά να παράγουν γάλα. Ο Κάλεν και ο Σέιφρεντ πίστευαν ότι η έκθεση στα οιστρογόνα πυροδοτεί μια σειρά γεγονότων που καταλήγουν στη δημιουργία ενός γιγαντιαίου βρόχου DNA. Αυτός ο βρόχος συνδέει τον προαγωγέα του γονιδίου προλακτίνης, ο οποίος λειτουργεί ως διακόπτης για την ενεργοποίηση του γονιδίου, με έναν ενισχυτή προλακτίνης, ο οποίος χρησιμεύει ως το μεταφορικό δάκτυλο που αναποδογυρίζει τον διακόπτη. Το καθήκον της Κάλεν για το διδακτορικό της ήταν να το επαληθεύσει.
Έψαξε για αυτόν τον βρόχο χρησιμοποιώντας μια τεχνική που αναπτύχθηκε πρόσφατα από τον Seyfred που ονομάζεται προσδιορισμός απολίνωσης εγγύτητας. Το πρώτο βήμα είναι η επεξεργασία του γονιδιώματος με φορμαλδεΰδη, η οποία δημιουργεί διασταυρώσεις μεταξύ τμημάτων του DNA που είναι κοντά το ένα στο άλλο στη φυσική τρισδιάστατη μορφή του γονιδιώματος. Η διαδικασία αποκαλύπτει ποια μέρη του γονιδιώματος αγγίζουν ακόμα κι αν αυτές οι αλληλουχίες είναι πολύ μακριά η μία από την άλλη στο γραμμικό γονιδίωμα. Ο Cullen διαπίστωσε ότι η έκθεση σε οιστρογόνα δημιουργεί έναν βρόχο που συνδέει τον ενισχυτή προλακτίνης και τον προαγωγέα. Η ανακάλυψή της της χάρισε μια δημοσίευση το 1993 στο Science και την έστειλε καλά στο δρόμο της για το διδακτορικό της.
Η εργασία του Cullen πρόσφερε μερικές από τις πρώτες άμεσες αποδείξεις ότι η μεγαλύτερη τρισδιάστατη δομή του γονιδιώματος σχετίζεται με τη λειτουργία του. Αλλά το άρθρο της δεν έλαβε ιδιαίτερη προσοχή. «Δεν σκεφτόμουν την αρχιτεκτονική του γονιδιώματος εκείνη την εποχή. Ο όρος δεν ήταν καν όρος τότε», είπε ο Κάλεν.
Τα πράγματα είχαν αλλάξει μια δεκαετία αργότερα, όταν έλαβε μια αιφνιδιαστική κλήση από τον Erez Lieberman Aiden, εκείνη την εποχή επισκέπτρια συνεργάτης στο Πανεπιστήμιο του Χάρβαρντ, ο οποίος έψαχνε για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον προσδιορισμό απολίνωσης που είχε χρησιμοποιήσει. Ο Aiden είχε μεγάλες φιλοδοξίες για αυτό. Δεν ήθελε να χρησιμοποιήσει απλώς την ανάλυση σε ένα γονίδιο. Αντίθετα, ήθελε να ψάξει σε ολόκληρο το γονιδίωμα, εντοπίζοντας όχι μόνο έναν βρόχο αλλά ενδεχομένως χιλιάδες από αυτούς.
Τα επόμενα χρόνια, ο Aiden, ο οποίος είναι πλέον υπολογιστικός βιολόγος στο Πανεπιστήμιο Rice και στο Baylor College of Medicine, βασίστηκε στη δουλειά του Job Dekker, βιολόγο στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Μασαχουσέτης, για να δημιουργήσει το σύστημα Hi-C, το οποίο χαρτογραφεί την πιθανότητα δύο κομμάτια του γονιδιώματος να αγγίζουν το ένα το άλλο.
«Συναντάμε τον διπλανό μας γείτονα περισσότερο από κάποιον που ζει σε άλλη χώρα. Είναι η ίδια ιδέα εδώ», είπε ο Aiden. "Αν γνωρίζουμε ποιος χτυπά ποιον σε μια συνηθισμένη ημέρα του γονιδιώματος, τότε μπορούμε να καταλάβουμε πόσο κοντά είναι αυτές οι περιοχές και κατά συνέπεια πώς φαίνεται το γονιδίωμα σε τρεις διαστάσεις."
Ο Aiden και οι συνεργάτες του δημοσίευσαν τα αποτελέσματα των αρχικών πειραμάτων Hi-C το 2009. Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν την αρχιτεκτονική του γονιδιώματος σε ανάλυση 1 εκατομμυρίου ζευγών βάσεων - ένα περίγραμμα pointillist που άρχισε να αποκαλύπτει την εκθαμβωτική πολυπλοκότητα του γονιδιώματος. «Τα αποτελέσματα ήταν σαν ένας χάρτης του κόσμου που σου έδινε μόνο τα ασαφή περιγράμματα των ηπείρων», είπε ο Σούχας Ράο, ένας μεταπτυχιακός φοιτητής που εργάζεται στο εργαστήριο του Άιντεν. "Δεν μπορούσατε πραγματικά να πλοηγηθείτε μαζί τους, αλλά ήταν ένα μέρος για να ξεκινήσετε."
Το εργαστήριο Aiden πέρασε τα επόμενα χρόνια βελτιώνοντας το Hi-C και, το 2014, δημοσίευσε μια εργασία στο Cell που χάραξε κάθε βρόχο και πηνίο DNA σε ανάλυση 1.000 ζευγών βάσεων. Εάν η εφημερίδα του 2009 αποκάλυψε τα θολά περιγράμματα της Βόρειας Αμερικής, το νέο Hi-C εξέθεσε ένα πλέγμα δρόμων του Μανχάταν. Η λεπτομέρεια έδωσε στους επιστήμονες μερικές από τις πρώτες ενδείξεις τους σχετικά με τους κανόνες με τους οποίους αναδιπλώνεται το γονιδίωμα.
Από όλα τα δισεκατομμύρια επαφές μεταξύ του DNA που δημιούργησε το Hi-C του Aiden, ξεχώρισε μια περιοχή του γονιδιώματος. Στα XX θηλυκά κύτταρα, ο Rao, ο Aiden και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι ενώ το ένα X μοιράζεται μοτίβα βρόχων με τα υπόλοιπα χρωμοσώματα, το ανενεργό X φαινόταν πολύ διαφορετικό. Αντί να έχει πολλαπλούς βρόχους περίπου 200.000 ζευγών βάσεων, το ανενεργό X είχε δύο τεράστιους «υπερτομείς» που χαρακτηρίζονται από πολλαπλούς «υπερβρόχους» έως και 77 εκατομμυρίων ζευγών βάσεων. Τι αγκυροβόλησε τα superloops; Μια αλληλουχία DNA που ονομάζεται DXZ4 - η ίδια που ο Chadwick είχε προηγουμένως αναγνωρίσει ως κλειδί για την αναδίπλωση του χρωμοσώματος Χ. Ο Τσάντγουικ διάβασε την εφημερίδα και άπλωσε το χέρι στον Έιντεν. Το ζευγάρι συμφώνησε να συνεργαστεί.
Μια γενετική τομή
Η κατανόηση της σχέσης μεταξύ της δομής ενός μορίου και της λειτουργίας του είναι ένα κλασικό ερώτημα στη βιοχημεία. Οι επιστήμονες που μελετούσαν πρωτεΐνες κατέκτησαν αυτό το πεδίο έρευνας ξεκινώντας από τη δεκαετία του 1960 αλλάζοντας ένα δομικό στοιχείο αμινοξέος σε μια πρωτεΐνη και μετρώντας πώς άλλαξε την ικανότητα της πρωτεΐνης να κάνει τη δουλειά της. Ο Chadwick και ο Aiden ήθελαν να κάνουν κάτι παρόμοιο για να κατανοήσουν τη σχέση μεταξύ αλληλουχιών DNA και αρχιτεκτονικής γονιδιώματος. Όπως πολλά εργαστήρια γενετικής, στράφηκαν στο εργαλείο επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR, το οποίο μπορεί να λειτουργήσει ως ένα σύνολο βιομοριακών ψαλιδιών.
Για να αποδείξει ότι το DXZ4 επηρεάζει πραγματικά την αναδίπλωση του γονιδιώματος, η ομάδα πήρε ανθρώπινα κύτταρα και χρησιμοποίησε το CRISPR για να αποκόψει το τμήμα DXZ4 - ένα επαναλαμβανόμενο τμήμα DNA που διαρκεί για εκατοντάδες χιλιάδες νουκλεοτίδια. Στη συνέχεια χρησιμοποίησαν το Hi-C για να μετρήσουν πώς η τομή επηρέασε τον βρόχο των χρωμοσωμάτων. Όταν αφαίρεσαν το DXZ4, «αυτές οι γιγάντιες θηλιές εξαφανίστηκαν. Το χρωμόσωμα αρχίζει να μοιάζει με ένα κανονικό αυτόσωμα», είπε ο Aiden. "Έδειξε ότι μπορούσαμε να έχουμε καλό έλεγχο στο πώς αναδιπλώθηκε το γονιδίωμα."
Ανεξάρτητα, το εργαστήριο του Dekker είχε επίσης δείξει τον βασικό ρόλο του DXZ4 στην αναδίπλωση του ανενεργού χρωμοσώματος Χ σε ποντίκια. Αποκάλυψαν επίσης ότι το Xist γονίδιο - ο μοριακός διακόπτης που τυλίγει το ανενεργό χρωμόσωμα Χ - βοηθά στη δημιουργία του ορίου μεταξύ των δύο μεγάλων υπερτομέων σε αυτό το χρωμόσωμα. Και τα δύο έγγραφα του Dekker (δημοσιεύτηκε στο Nature ) και Aiden and Chadwick's (δημοσιεύτηκε στο Πρακτικά της Εθνικής Ακαδημίας Επιστημών ) συνέβαλαν στο ξεμπλέξιμο του Γόρδιου δεσμού της αναδίπλωσης του γονιδιώματος.
"Είναι πολύ θεαματικό το γεγονός ότι η δομή ενός ολόκληρου χρωμοσώματος θα βασίζεται σε μια μικρή αλληλουχία DNA κάπου στη μέση", δήλωσε ο Wouter de Laat, βιοϊατρικός γενετιστής στο Πανεπιστήμιο της Ουτρέχτης στην Ολλανδία.
Αυτά τα έγγραφα, είπε ο de Laat, διευρύνουν τις γνώσεις μας για τη στενή σχέση μεταξύ του τρόπου με τον οποίο αναδιπλώνεται ένα γονιδίωμα και του τρόπου λειτουργίας του. Οι επιστήμονες υποπτεύονται εδώ και καιρό ότι η μη φυσιολογική αναδίπλωση του γονιδιώματος μπορεί να προκαλέσει ασθένειες και αρκετές νέες μελέτες έχουν εντοπίσει συνδέσμους μεταξύ της αρχιτεκτονικής του γονιδιώματος και της βιολογικής ανάπτυξης. Μια μελέτη του 2016 από τον Stefan Mundlos στο Ινστιτούτο Μοριακής Γενετικής Max Planck στο Βερολίνο και τους συνεργάτες του έδειξε ότι μια αναδιάταξη του DNA σε μια μη κωδικοποιητική περιοχή του γονιδιώματος προκάλεσε δυσμορφίες των άκρων κατά την ανάπτυξη αλλάζοντας την αναδίπλωση της χρωματίνης. Άλλοι ερευνητές χρησιμοποιούν το CRISPR για να διερευνήσουν εάν οι αλλαγές στην αρχιτεκτονική του γονιδιώματος επηρεάζουν την ικανότητα παρασίτων όπως το Trypanosoma , η αιτία της αφρικανικής ασθένειας του ύπνου, για να αποφύγει το ανοσοποιητικό σύστημα.
Γίνεται προφανές ότι στο γονιδίωμα, όπως λέει ο Dekker, «τίποτα δεν έχει νόημα εκτός από το 3-D».
