Διαφορά μεταξύ PCR και QPCR

Κύρια διαφορά – PCR έναντι QPCR

Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) και η qPCR (ποσοτική PCR) είναι δύο τεχνικές που χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για την ενίσχυση του DNA για διάφορους σκοπούς. Η PCR είναι μια σχετικά απλή τεχνική. Η qPCR είναι επίσης γνωστή ως PCR σε πραγματικό χρόνο ήψηφιακή PCR . Η κύρια διαφορά μεταξύ PCR και qPCR είναι ότι Η PCR είναι μια ποιοτική τεχνική ενώ η qPCR είναι μια ποσοτική τεχνική . Η PCR επιτρέπει την ανάγνωση του αποτελέσματος ως «παρουσία ή απουσία». Αλλά στην qPCR, η ποσότητα του DNA που ενισχύεται σε κάθε κύκλο προσδιορίζεται ποσοτικά. Εάν χρησιμοποιείται RNA στην PCR, η τεχνική είναι γνωστή ως RT-PCR (αντίστροφη μεταγραφή PCR) και εάν χρησιμοποιείται RNA στην qPCR, η τεχνική είναι γνωστή ως qRT-PC.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι η PCR
     – Ορισμός, διεργασίες, χρήσεις
2. Τι είναι το QPCR
     – Ορισμός, διεργασίες, χρήσεις
3. Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ PCR και QPCR
     – Περίληψη κοινών χαρακτηριστικών
4. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ PCR και QPCR
     – Σύγκριση βασικών διαφορών

Βασικοί όροι:Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης, αμπλικόνια, πολυμεράση DNA, φθορίζουσα χρωστική, PCR, ανιχνευτές, qPCR, RT-qPCR

Τι είναι η PCR

Η PCR αναφέρεται σε μια τεχνική στη βιοτεχνολογία που επιτρέπει την ανάλυση μιας σύντομης αλληλουχίας DNA ενισχύοντας ένα επιλεγμένο τμήμα DNA. Είναι συγκριτικά μια ευαίσθητη μέθοδος καθώς απαιτούνται πολύ μικροί όγκοι από μία μόνο αντίδραση. Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα της DNA πολυμεράσης να συνθέτει νέους κλώνους DNA στον προσφερόμενο κλώνο μήτρας με συμπληρωματικό τρόπο. Το μίγμα αντίδρασης της PCR αποτελείται από πολυμεράση DNA, νουκλεοτίδια DNA, εκκινητές, το εκμαγείο DNA που πρόκειται να ενισχυθεί και μαγνήσιο. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μέσα σε έναν θερμοκυκλωτή. Η DNA πολυμεράση θα πρέπει να είναι ανθεκτική στη θερμότητα καθώς χρησιμοποιούνται υψηλές θερμοκρασίες σε αυτή την αντίδραση. Οι δύο τύποι πολυμερασών DNA που χρησιμοποιούνται στην PCR είναι το Taq DNA πολυμεράση και Pfu DNA πολυμεράση. Taq Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιείται ευρέως στην PCR.

Η πολυμεράση DNA απαιτεί έναν προϋπάρχοντα κλώνο DNA στο 3′ άκρο για τη σύνθεση ενός νέου κλώνου. Ως εκ τούτου, ένας ολιγονουκλεοτιδικός εκκινητής προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης για την έναρξη της σύνθεσης DNA. Η απαίτηση ενός εκκινητή στην PCR επιτρέπει την ενίσχυση μόνο μιας συγκεκριμένης περιοχής στο εκμαγείο. Η αλληλουχία στόχος πλαισιώνεται από εμπρόσθιους και ανάστροφους εκκινητές. Στο τέλος μιας PCR, νέα αντίγραφα μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, τα οποία ονομάζονται amplicons , συσσωρεύονται σε δισεκατομμύρια. Τα συστατικά της PCR θα πρέπει να βελτιστοποιούνται με τέτοιο τρόπο ώστε να βελτιώνεται η απόδοση της PCR, ελαχιστοποιώντας παράλληλα την αποτυχία. Η τυπική αντίδραση PCR φαίνεται στο σχήμα 1.

Εικόνα 1:PCR

Βήματα PCR

Τα τρία βήματα μιας PCR περιγράφονται παρακάτω.

1. Μετουσίωση – Το δίκλωνο πρότυπο DNA διαχωρίζεται σε δύο μονούς κλώνους με θέρμανση στους 94-95 °C.
2. Ανόπτηση – Τα μπροστινά και τα αντίστροφα εκκινητές συνδέονται με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες στο πρότυπο. Η θερμοκρασία εξαρτάται από τη θερμοκρασία τήξης του συνδυασμού ασταριού.
3. Επέκταση Primer – Το ένζυμο πολυμεράσης DNA επεκτείνει κάθε εκκινητή στο 3' άκρο του προσθέτοντας συμπληρωματικές βάσεις στον αναπτυσσόμενο κλώνο. Η βέλτιστη θερμοκρασία του Taq πολυμεράση, δηλ. 72°C, χρησιμοποιείται ως θερμοκρασία στο στάδιο επέκτασης. Ο χρόνος της επέκτασης εξαρτάται από τον αριθμό των ζευγών βάσεων στο σκέλος του προτύπου.

Τα τρία βήματα επαναλαμβάνονται 28-35 φορές. Η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης χρησιμοποιείται στην κλασμάτωση μεγέθους προϊόντων PCR. Το προϊόν χρωματίζεται με βρωμιούχο αιθίδιο και παρατηρείται υπό υπεριώδη ακτινοβολία. Το προϊόν PCR ή το ενισχυμένο DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για κλωνοποίηση, προσδιορισμό αλληλουχίας ή γονότυπο.

Τι είναι το QPCR

Το QPCR αναφέρεται σε μια τεχνική στη βιοτεχνολογία που επιτρέπει την ανίχνευση, τον χαρακτηρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό νουκλεϊκών οξέων για διάφορες εφαρμογές. Ως εκ τούτου, είναι ένας τύπος ποσοτικής PCR. Τόσο το DNA όσο και το RNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως qPCR. Εάν χρησιμοποιείται RNA ως πρότυπο, θα πρέπει πρώτα να μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA. Έτσι, αυτός ο τύπος qPCR είναι γνωστός ως RT-qPCR . Η παραδοσιακή PCR πραγματοποιείται για cDNA ή συνηθισμένο δείγμα DNA. Ωστόσο, στην qPCR, χρησιμοποιούνται φθορίζουσες βαφές για την επισήμανση του προϊόντος PCR σε κάθε στάδιο του κύκλου PCR. Αυτό επιτρέπει τη συλλογή δεδομένων καθώς προχωρά η PCR, επιτρέποντας τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμπλικονίων κατά την εκθετική φάση της PCR. Ο κύριος τύπος βαφής που χρησιμοποιείται στην qPCR είναι το SYBR Green. Η βαφή συνδέεται με το δίκλωνο DNA. Καθώς ο φθορισμός αυξάνεται αναλογικά με την ποσότητα του ενισχυμένου DNA, η ποσοτικοποίηση μπορεί να γίνει σε «πραγματικό χρόνο». Το κύριο μειονέκτημα της χρήσης της βαφής είναι ότι επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός συγκεκριμένου προϊόντος στο δείγμα. Εκτός από τις βαφές, οι ανιχνευτές μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν στη διαδικασία ποσοτικοποίησης. Οι ανιχνευτές TaqMan είναι ένας από τους κύριους τύπους ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται στην qPCR και η διαδικασία εκπομπής φθορισμού φαίνεται στην εικόνα 2 .

Εικόνα 2:TaqMan Probe

Οι ανιχνευτές μπορούν να σχεδιαστούν με τέτοιο τρόπο ώστε να ανιχνεύουν πολλά προϊόντα PCR στο ίδιο δείγμα. Ο ανιχνευτής TaqMan είναι ένας από τους κύριους τύπους ανιχνευτών υδρόλυσης. Η ενσωμάτωση αυτού του ανιχνευτή στο προϊόν PCR εκθέτει το φθοροφόρο, εκπέμποντας τον φθορισμό. Οι φθορίζουσες βαφές είναι πιο συγκεκριμένες για το προϊόν PCR. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται στις περισσότερες διαγνωστικές δοκιμασίες για την ανίχνευση του προϊόντος PCR.

Similarities Between PCR and QPCR

• Η PCR και η qPCR είναι δύο τύποι τεχνικών που χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για την ενίσχυση του DNA για διάφορους σκοπούς.
• Η παραδοσιακή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης εκτελείται ως βασική τεχνική τόσο στην PCR όσο και στην qPCR.
• Το RNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο στην PCR όσο και στην qPCR χρησιμοποιώντας την αντίστροφη μεταγραφή ως πρώτη αντίδραση.

Διαφορά μεταξύ PCR και QPCR

Ορισμός

PCR: Η PCR είναι μια τεχνική στη βιοτεχνολογία που επιτρέπει την ανάλυση μιας σύντομης αλληλουχίας DNA ενισχύοντας ένα επιλεγμένο τμήμα DNA.

QPCR: Το QPCR είναι μια τεχνική στη βιοτεχνολογία που επιτρέπει την ανίχνευση, τον χαρακτηρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό νουκλεϊκών οξέων για διάφορες εφαρμογές.

Ποσοτικά/Ποιοτικά

PCR: Η PCR είναι ποιοτική τεχνική.

QPCR: Η QPCR είναι μια ποσοτική τεχνική.

Εντοπισμός του προϊόντος

PCR: Το προϊόν ανιχνεύεται με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης σε PCR.

QPCR: Το προϊόν μπορεί να ανιχνευθεί σε κάθε κύκλο ενίσχυσης σε qPCR.

Συλλογή δεδομένων

PCR: Τα δεδομένα συλλέγονται στο τέλος της αντίδρασης σε PCR.

QPCR: Τα δεδομένα συλλέγονται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της αντίδρασης σε qPCR.

Ανάλυση

PCR: Η PCR έχει πολύ κακή ανάλυση.

QPCR: Το QPCR έχει πολύ υψηλή ανάλυση.

Βαφές

PCR: Η PCR χρησιμοποιεί βρωμιούχο αιθίδιο για τη χρώση του προϊόντος κατά τη διάρκεια της PCR.

QPCR: Το QPCR χρησιμοποιεί φθορίζουσες βαφές για την ανίχνευση του προϊόντος.

Ώρα

PCR: Η PCR είναι μια πιο χρονοβόρα μέθοδος.

QPCR: Το QPCR είναι λιγότερο χρονοβόρο.

RNA

PCR: Το RT-PCR είναι ο τύπος PCR που χρησιμοποιεί το RNA ως πρότυπο.

QPCR: Το RT-qPCR είναι ο τύπος qPCR που χρησιμοποιεί το RNA ως πρότυπο.

Ρόλος

PCR: Η PCR χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας ή απουσίας ορισμένων γονιδιωματικών θραυσμάτων.

QPCR: Το QPCR χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση ενός συγκεκριμένου θραύσματος σε ένα δείγμα.

Συμπέρασμα

Η PCR και η qPCR είναι δύο τύποι τεχνικών που χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για την ενίσχυση του DNA για διάφορους σκοπούς. Η PCR είναι η παραδοσιακή μέθοδος ενίσχυσης που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση της παρουσίας ή απουσίας ενός θραύσματος DNA. Το QPCR χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση ενός συγκεκριμένου θραύσματος σε ένα δείγμα. Έτσι, η PCR είναι μια ποιοτική τεχνική ενώ η qPCR είναι μια ποσοτική τεχνική. Αυτή είναι η κύρια διαφορά μεταξύ PCR και qPCR.

Αναφορά:

1. "QPCR έναντι ψηφιακής PCR έναντι παραδοσιακής PCR." Thermo Fisher Scientific , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "PCR" By Madprime – Δικό έργο (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia
2. "Taqman" Από χρήστη:Braindamaged – Δική του δουλειά από τον αρχικό χρήστη (Δημόσιος Τομέας) μέσω του Commons Wikimedia