Πώς βοηθούν οι φθορίζοντες δείκτες στον προσδιορισμό μιας νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

Η αλληλουχία DNA είναι μια τεχνική που βοηθά στον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός συγκεκριμένου μορίου DNA. Οι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας είναι η αλληλουχία Sanger και η αλληλουχία επόμενης γενιάς. Και οι δύο τύποι μεθόδων αλληλουχίας είναι πλήρως αυτοματοποιημένοι ενημερωμένοι. Οποιοσδήποτε κλώνος DNA αποτελείται από τα τέσσερα νουκλεοτίδια:αδενίνη (Α), γουανίνη (G), κυτοσίνη (C) και θυμίνη (Τ). Τα νουκλεοτίδια στο θραύσμα DNA επισημαίνονται με τέσσερις ξεχωριστούς, φθορίζοντες δείκτες και στους δύο τύπους μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας. Οι φθορίζοντες δείκτες ή τα φθοροφόρα είναι μόρια ικανά να απορροφούν φως και να το εκπέμπουν σε ένα καλά καθορισμένο μήκος κύματος. Οι φθορίζοντες δείκτες ενσωματώνονται στον κλώνο DNA με PCR. Στη συνέχεια, η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων προσδιορίζεται με αυτοματοποιημένες τεχνικές.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι η Αλληλουχία
     – Ορισμός, Αλληλουχία Sanger, Αλληλουχία επόμενης γενιάς
2. Πώς βοηθούν οι φθορίζοντες δείκτες στον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων
     – Διαδικασία αλληλουχίας

Βασικοί όροι:διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs), δείκτης φθορισμού, ηλεκτροφόρηση γέλης, αλληλουχία επόμενης γενιάς, αλληλουχία νουκλεοτιδίων, PCR, αλληλουχία Sanger 

Τι είναι η αλληλουχία

Η αλληλούχιση είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός μορίου DNA. Δύο κύριοι τύποι μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας DNA μπορούν να αναγνωριστούν ως η αλληλούχιση Sanger και η αλληλούχιση επόμενης γενιάς. Τόσο η αλληλουχία Sanger όσο και η αλληλουχία επόμενης γενιάς χρησιμοποιούν επισημασμένα νουκλεοτίδια με φθορισμό για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας.

Sanger Sequencing

Η αλληλούχιση Sanger είναι η πρώτη ανεπτυγμένη μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Η μέθοδος της αλληλουχίας αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τον Fredric Sanger το 1975. Κατά συνέπεια, είναι γνωστή ως αλληλουχία Sanger. Η μέθοδος της αλληλουχίας Sanger είναι επίσης γνωστή ως μέθοδος τερματισμού αλυσίδας καθώς εμπλέκεται στην επιλεκτική ενσωμάτωση διδεοξυνουκλεοτιδίων που τερματίζουν την αλυσίδα (ddNTPS) από την πολυμεράση DNA κατά τη διάρκεια in vitro σύνθεση DNA. Η επιμήκυνση του κλώνου του DNA επιτυγχάνεται από τα κανονικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs). Ωστόσο, ddNTPs προστίθενται στο μίγμα αντίδρασης για να τερματιστεί η ανάπτυξη της αλυσίδας. Αυτά τα ddNTP είναι σημασμένα με φθορισμό. Οι τέσσερις τύποι ddNTP προστίθενται σε τέσσερα ξεχωριστά μείγματα PCR. Επομένως, πραγματοποιούνται τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις PCR προσθέτοντας ddATP, ddGTP, ddCTP και ddTTP. Σε κάθε μίγμα αντίδρασης, η ανάπτυξη της αλυσίδας τερματίζεται σε κάθε νουκλεοτίδιο Α, G, C και Τ αντίστοιχα. Για παράδειγμα, στο μίγμα αντίδρασης με προστιθέμενο ddATP, η ανάπτυξη διαφορετικών αμπλικονίων τερματίζεται σε κάθε νουκλεοτίδιο Α στο θραύσμα DNA. Στη συνέχεια, αυτές οι τέσσερις αντιδράσεις διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση γέλης και χρησιμοποιείται ένα φθορόμετρο για τη σάρωση για τον ξεχωριστό φθορισμό. Η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των θραυσμάτων που χρησιμοποιούνται στην κλωνοποίηση DNA και των θραυσμάτων που ενισχύονται με PCR. Οι προσδιορισμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων φαίνονται στο σχήμα 1.

Εικόνα 1:Αλληλουχίες DNA

Αλληλουχία επόμενης γενιάς

Οι πιο πρόσφατες τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας DNA είναι συλλογικά γνωστές ως αλληλουχία επόμενης γενιάς. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας εκτελούνται σε μικροκλίμακα σε ένα τσιπ ταυτόχρονα. Επομένως, πολλές αντιδράσεις αλληλουχίας εκτελούνται παράλληλα. Στην αλληλουχία επόμενης γενιάς, η τριχοειδική ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται επιπλέον της ηλεκτροφόρησης γέλης για τον διαχωρισμό αμλικονίων με διάφορα μήκη που δημιουργούνται με τη μέθοδο τερματισμού αλυσίδας. Η τριχοειδική ηλεκτροφόρηση είναι μια αναλυτική μέθοδος διαχωρισμού με την οποία τα μόρια διαχωρίζονται με βάση την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα.

Πώς οι κατασκευαστές φθορισμού βοηθούν στον προσδιορισμό μιας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων

Κατά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας, το DNA που πρόκειται να προσδιοριστεί η αλληλουχία χρησιμεύει ως η μήτρα κλώνου για τη σύνθεση DNA με PCR. Ένας εκκινητής DNA χρησιμοποιείται για την έναρξη της σύνθεσης DNA από την πολυμεράση DNA. Ένα μείγμα κανονικών, τεσσάρων βάσεων (dNTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) και ένα χαμηλό επίπεδο ενός από τα τέσσερα διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs, ddATP, ddGTP, ddCTP και ddTTP) προστίθενται ως συστατικά της αντίδρασης PCR. Ως εκ τούτου, πραγματοποιούνται τέσσερις μεμονωμένες αντιδράσεις PCR με την προσθήκη καθενός από τα τέσσερα ddNTP. Τα διδεοξυνουκλεοτίδια έχουν δύο ειδικά χαρακτηριστικά:

1. Δεν έχουν ομάδα 3'-OH στην οποία προστίθεται το εισερχόμενο νουκλεοτίδιο από την πολυμεράση DNA. Ως εκ τούτου, η ενσωμάτωση του ddNTP τερματίζει την ανάπτυξη της αλυσίδας.
2. Εχουν επισημανθεί με διαφορετικές φθορίζουσες βαφές:το ddATP επισημαίνεται με πράσινη βαφή , το ddGTP επισημαίνεται με μια κίτρινη βαφή , το ddCTP επισημαίνεται με μπλε , και το ddTTP επισημαίνεται με κόκκινη βαφή .

Ωστόσο, τα ddNTP που τερματίζουν την αλυσίδα προστίθενται σε χαμηλές συγκεντρώσεις. δεν τερματίζουν ολόκληρη τη διαδικασία PCR ταυτόχρονα. Όμως, όταν ένα από τα τέσσερα ddNTP ενσωματωθεί στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα, η συγκεκριμένη ανάπτυξη της αλυσίδας τερματίζεται. Επομένως, στο τέλος κάθε τεσσάρων αντιδράσεων PCR, παράγεται μια σειρά από αμπλικόνια (τα θραύσματα DNA που προκύπτουν με PCR), τα οποία τερματίζονται σε κάθε νουκλεοτίδιο του θραύσματος DNA στόχου . Αυτά τα amplicons μπορούν να εκτελεστούν σε gel. Οι φθορίζουσες βαφές που περνούν σε ένα καθορισμένο σημείο της ηλεκτροφορητικής γέλης μπορούν να σαρωθούν από ένα φθορόμετρο προκειμένου να προσδιοριστεί η αλληλουχία νουκλεοτιδίων στους αυτοματοποιημένους προσδιοριστές αλληλουχίας DNA. Η σημασμένη με φθορισμό αλληλουχία νουκλεοτιδίων που λαμβάνεται στον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA φαίνεται στο σχήμα 2 .

Εικόνα 2:Αλληλουχία νουκλεοτιδίων με σήμανση φθορισμού

Με το συνδυασμό καθενός από τα νουκλεοτίδια της σειράς, μπορεί να προσδιοριστεί η νουκλεοτιδική αλληλουχία του αρχικού θραύσματος DNA. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός θραύσματος με 750-1.000 ζεύγη βάσεων μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί ανά εκτέλεση με ανάλυση αλληλουχίας Sanger. Ωστόσο, η αλληλουχία ενός ολόκληρου γονιδιώματος παραμένει ακόμη αμφισβητήσιμη λόγω της παρουσίας μεγάλου αριθμού νουκλεοτιδίων. Η αλληλουχία 454 είναι ένας τύπος αλληλουχίας επόμενης γενιάς με τον οποίο μπορούν να διαβαστούν 20 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων ανά μεμονωμένη εκτέλεση.

Συμπέρασμα

Η αλληλούχιση είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Η αλληλουχία Sanger και η αλληλουχία επόμενης γενιάς είναι οι δύο κύριες τεχνολογίες αλληλούχισης. Και οι δύο τεχνολογίες χρησιμοποιούν φθορίζοντες δείκτες για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Καθένα από τα τέσσερα διδεοξυνουκλεοτίδια που τερματίζουν την αλυσίδα είναι επισημασμένο με τέσσερις διαφορετικές φθορίζουσες βαφές και χρησιμοποιούνται σε τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις PCR για να ληφθεί η αλληλουχία.

Αναφορά:

1. Adams, Jill U. «Τεχνολογίες αλληλουχίας DNA». Nature News, Nature Publishing Group, Διαθέσιμο εδώ.
2. Carr, Steven M. Fluorescent sequencing, Διαθέσιμο εδώ.
3. "Sequencing DNA – Automated Sequencing With Fluorescent Dyes." Άρθρα JRank, Διαθέσιμα εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "Alineando secuencias (2)" από τον Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) μέσω Flickr
2. "Radioactive Fluorescent Seq" Από τον Abizar στην αγγλική Wikipedia (CC BY-SA 3.0) μέσω του Commons Wikimedia