Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Sanger Sequencing και Pyrosequencing

Η κύρια διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας Sanger και της πυροαλληλουχίας είναι ότι Η αλληλούχιση Sanger είναι μια προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που χρησιμοποιεί τη μέθοδο τερματισμού της διδεοξυαλυσίδας, ενώ η πυροαλληλουχία είναι μια προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται στην αρχή προσδιορισμού αλληλουχίας ανά σύνθεση. Επομένως, στον προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger, η ταυτοποίηση των νουκλεοτιδίων γίνεται με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση μετά την ενίσχυση ολόκληρου του θραύσματος DNA ενώ στον προσδιορισμό αλληλουχίας πυροσύνθεσης, η ταυτοποίηση των νουκλεοτιδίων γίνεται με την απελευθέρωση πυροφωσφορικού κατά τη σύνθεση.

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Sanger και ο προσδιορισμός pyrosequencing είναι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Το πρώτο είναι το «χρυσό πρότυπο» για τους περισσότερους στόχους, ενώ το δεύτερο είναι η πρώτη εναλλακτική στη συμβατική μέθοδο αλληλουχίας Sanger.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται 

1. Τι είναι η αλληλουχία Sanger
     – Ορισμός, Διαδικασία, Σημασία
2. Τι είναι η Pyrosequencing
     – Ορισμός, Διαδικασία, Σημασία
3. Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ του Sanger Sequencing και του Pyrosequencing
      – Περίληψη κοινών χαρακτηριστικών
4. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ του Sanger Sequencing και του Pyrosequencing
      – Σύγκριση βασικών διαφορών

Βασικοί όροι 

Αλληλουχία DNA, PCR, Pyrophosphate, Pyrosequencing, Sanger Sequencing, Sensitivity

Τι είναι το Sanger Sequencing 

Η αλληλούχιση Sanger είναι η μέθοδος πρώτης γενιάς προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τον Fredric Sanger το 1977. Επιπλέον, η βάση της αλληλουχίας Sanger είναι η μέθοδος τερματισμού της διδεοξυ αλυσίδας.

Sanger Sequencing – Διαδικασία 

Στον προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger, η DNA πολυμεράση είναι υπεύθυνη για την επιλεκτική ενσωμάτωση διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddNTPs) που τερματίζουν την αλυσίδα κατά τη διάρκεια της in vitro σύνθεσης DNA. Επομένως, τα διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs) επισημαίνονται με φθορισμό στο αμπλικόνιο με PCR. Εδώ, το ddATP επισημαίνεται με πράσινη βαφή. το ddGTP επισημαίνεται με κίτρινη βαφή. το ddCTP επισημαίνεται με μπλε και το ddTTP επισημαίνεται με κόκκινη βαφή) Στη συνέχεια, τα αμπλικόνια που προκύπτουν διαχωρίζονται με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση ενώ ανιχνεύονται τα σημασμένα με φθορισμό νουκλεοτίδια.

Εικόνα 1:Μέθοδος αλληλουχίας Sanger

Sanger Sequencing – Σημασία 

Ωστόσο, η μέθοδος αλληλουχίας Sanger έχει αρκετούς περιορισμούς, συμπεριλαμβανομένης της αδυναμίας επεξεργασίας εξόδου μεγαλύτερης αλληλουχίας, της παράλληλης ανάλυσης λιγότερων δειγμάτων, της αδυναμίας του συνολικού αυτοματισμού της προετοιμασίας του δείγματος, του υψηλότερου κόστους, της αλληλουχίας λάθη, λιγότερη ευαισθησία (10-20%), η οποία είναι ανεπαρκής για την ανίχνευση μεταλλαγμένων αλληλόμορφων χαμηλού επιπέδου κ.λπ. Παρά τους περιορισμούς αυτούς, είναι το «χρυσό πρότυπο» για την αλληλούχιση σε πολλές κλινικές διαδικασίες.

Τι είναι η Pyrosequencing 

Η Pyrosequencing είναι η πρώτη εναλλακτική στη συμβατική αλληλουχία Sanger. Είναι ένας τύπος αλληλουχίας επόμενης γενιάς που αναπτύχθηκε στο Βασιλικό Ινστιτούτο Τεχνολογίας (KTH). Επιπλέον, αυτή η μέθοδος βασίζεται στη φωτομετρική ανίχνευση πυροφωσφορικού (PPi) που απελευθερώνεται κατά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων που καταλύεται από πολυμεράση DNA κατευθυνόμενη από εκκινητή.

Pyrosequencing – Διαδικασία 

Γενικά, τέσσερα ένζυμα χρησιμοποιούνται σε αυτήν τη μέθοδο για την ακριβή ανίχνευση των ενσωματωμένων νουκλεοτιδίων. Είναι η πολυμεράση DNA, η σουλφουρυλάση ATP, η λουσιφεράση και η απυράση. Επιπλέον, ο εκκινητής προσδιορισμού αλληλουχίας υβριδοποιείται με ένα μονόκλωνο πρότυπο σημασμένο με βιοτίνη DNA. Επιπλέον, τα τέσσερα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs), η 5' φωσφοθειική αδενοσίνη (APS) και η λουσιφερίνη είναι τα υποστρώματα στο μείγμα αντίδρασης.

Εικόνα 2:Μέθοδος Pyrosequencing

Όταν ξεκινά ο καταρράκτης πολυμερισμού, απελευθερώνεται ανόργανος PPi ως αποτέλεσμα της ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων από την πολυμεράση. Ωστόσο, η ποσότητα του απελευθερωμένου PPi είναι ισομοριακή με την ποσότητα του ενσωματωμένου νουκλεοτιδίου σε κάθε κύκλο. Στη συνέχεια, η σουλφουρυλάση ATP μετατρέπει το απελευθερωμένο PPi σε ATP παρουσία APS με ποσοτικό τρόπο. Το παραγόμενο ATP οδηγεί τη μετατροπή της λουσιφερίνης σε οξυλουσιφερίνη με τη μεσολάβηση του ενζύμου λουσιφεράσης. Επίσης, αυτή η αντίδραση παράγει αναλογικά ορατό φως στην ποσότητα των ATP. Στη συνέχεια, αυτό το φως μπορεί να ανιχνευθεί στο μήκος κύματος 560 nm.

Επιπλέον, η κύρια λειτουργία του ενζύμου απυράσης είναι η συνεχής αποικοδόμηση του ATP καθώς και των μη ενσωματωμένων dNTP στο μίγμα της αντίδρασης. Επομένως, νέα dNTP πρέπει να προστεθούν στην αντίδραση ένα κάθε φορά σε ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, το οποίο είναι 65 δευτερόλεπτα. Όπως είναι γνωστό το προστιθέμενο νουκλεοτίδιο, η αλληλουχία του εκμαγείου μπορεί να προσδιοριστεί.

Pyrosequencing – Σημασία 

Επιπλέον, η pyrosequencing είναι μια ευρέως εφαρμόσιμη τεχνική με υψηλή ακρίβεια, παράλληλη επεξεργασία και εύκολα αυτοματοποιημένη. Επίσης, αποφεύγει τη χρήση επισημασμένων εκκινητών, σημασμένων νουκλεοτιδίων και ηλεκτροφόρησης γέλης. Επιπλέον, είναι κατάλληλο τόσο για επιβεβαιωτική αλληλουχία όσο και για de novo αλληλουχία. Επιπλέον, το κύριο σημαντικό χαρακτηριστικό του pyrosequencing είναι το βάθος αλληλουχίας του, το οποίο επιτρέπει την ανίχνευση παραλλαγών με υψηλή ευαισθησία. Ωστόσο, το κύριο μειονέκτημα της τεχνικής είναι η καταλληλότητά της για αλληλουχία έως και αρκετές εκατοντάδες βάσεων.

Ομοιότητες μεταξύ Sanger Sequencing και Pyrosequencing 

• Η αλληλουχία Sanger και η pyrosequencing είναι δύο προσεγγίσεις για Αλληλουχία DNA.
• Είναι υπεύθυνοι για την αναγνώριση του νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός θραύσματος DNA που μας ενδιαφέρει.
• Και τα δύο είναι καλύτερα για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας μικρότερων θραυσμάτων DNA .
• Ωστόσο, έχουν τις δικές τους εφαρμογές ανάλογα σχετικά με τη διαδικασία αλληλουχίας και τα οφέλη τους.

Διαφορά μεταξύ Sanger Sequencing και Pyrosequencing 

Ορισμός 

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Sanger αναφέρεται σε μια μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας DNA με την επιλεκτική ενσωμάτωση διδεοξυνουκλεοτιδίων που τερματίζουν την αλυσίδα, ενώ ο προσδιορισμός πυροαλληλουχίας αναφέρεται σε μια μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται στην αρχή της αλληλουχίας προς σύνθεση .

Τύπος αλληλουχίας 

Η αλληλουχία Sanger είναι η πρώτης γενιάς προσέγγιση αλληλουχίας, ενώ η πυροαλληλουχία είναι η χημεία αλληλουχίας επόμενης γενιάς, η οποία είναι μια προσέγγιση αλληλουχίας δεύτερης γενιάς.

Συσχέτιση 

Επιπλέον, η αλληλουχία Sanger είναι η συμβατική μέθοδος και το «χρυσό πρότυπο» για τους περισσότερους στόχους, ενώ η πυροαλληλουχία είναι η πρώτη εναλλακτική στη συμβατική μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας.

Εφεύρεση 

Ο Frederick Sanger και οι συνεργάτες του ήταν οι πρώτοι που ανέπτυξαν την αλληλουχία Sanger το 1977, ενώ ο Pål Nyrén και ο μαθητής του Mostafa Ronaghi ήταν οι πρώτοι που ανέπτυξαν την πυροαλληλουχία στο Βασιλικό Ινστιτούτο Τεχνολογίας στη Στοκχόλμη στην 1996. 

Εμπορευματοποίηση 

Ενώ η αλληλουχία Sanger κυκλοφόρησε για πρώτη φορά στο εμπόριο από την Applied Biosystems, η πυροσυλληλία χρησιμοποιείται στις πλατφόρμες Roche 454 και GS FLX Titanium.

Αρχή 

Πάνω απ 'όλα, η κύρια διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας Sanger και της πυροσυλληλίας είναι ότι η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιεί τη μέθοδο τερματισμού της διδεοξυ αλυσίδας, ενώ η πυροαλληλουχία βασίζεται στην αρχή της αλληλουχίας προς σύνθεση.

Προσδιορισμός νουκλεοτιδίων 

Στον προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger, η ταυτοποίηση των νουκλεοτιδίων γίνεται με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση μετά την ενίσχυση ολόκληρου του θραύσματος DNA, ενώ στον προσδιορισμό πυροαλληλουχίας, η ταυτοποίηση των νουκλεοτιδίων γίνεται με την απελευθέρωση πυροφωσφορικού κατά την σύνθεση.

Ανίχνευση 

Επιπλέον, η αλληλουχία Sanger περιλαμβάνει την ανίχνευση φωτός φθορισμού, ενώ η πυροσυλληλία περιλαμβάνει την ανίχνευση ορατού φωτός στα 560 nm.

Μήκος θραυσμάτων DNA 

Επιπλέον, η αλληλουχία Sanger μπορεί να διαβάσει έως και 800 έως 1000 ζεύγη βάσεων ενώ η pyrosequencing μπορεί να διαβάσει έως και 300-500 ζεύγη βάσεων.

Σημασία 

Η αλληλουχία Sanger είναι μια πολύπλοκη διαδικασία με πολλά βήματα, ενώ η πυροαλληλουχία είναι μια λιγότερο περίπλοκη διαδικασία με λιγότερα βήματα.

Ευαισθησία 

Επίσης, μια άλλη διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας Sanger και του pyrosequencing είναι ότι η αλληλουχία Sanger έχει χαμηλότερη ευαισθησία, ενώ η pyrosequencing μεγαλύτερη ευαισθησία.

Συμπέρασμα 

Η αλληλουχία Sanger είναι η πρώτης γενιάς προσέγγιση αλληλουχίας, η οποία είναι η συμβατική μέθοδος αλληλούχισης. Επίσης, είναι το «χρυσό πρότυπο» για πολλούς στόχους. Ωστόσο, χρησιμοποιεί τη μέθοδο τερματισμού της διδεοξυ αλυσίδας που ακολουθείται από τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Από την άλλη πλευρά, η πυροαλληλουχία είναι η πρώτη εναλλακτική στην αλληλουχία Sanger και είναι ένας τύπος αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Επιπλέον, έχει υψηλότερη ευαισθησία και λιγότερα βήματα για κάλυψη. Γενικά, χρησιμοποιεί τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας με σύνθεση, η οποία προσδιορίζει τα νουκλεοτίδια κατά τη σύνθεση του θραύσματος DNA ως έχει. Ως εκ τούτου, η κύρια διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας Sanger και του pyrosequencing είναι η μέθοδος αλληλούχισης και τα οφέλη τους.