Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Immunoblot και Western Blot

Σχετικά με τη διαφορά μεταξύ immunoblot και western blot, το immunoblot είναι το πιο ακριβές όνομα για το western blot, το οποίο είναι η τεχνική στη μοριακή βιολογία και την ανοσογενετική για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών που υπάρχουν σε ένα δείγμα . Εφόσον τα αντισώματα συμμετέχουν στη διαδικασία του western blot, μπορεί να ονομαστεί πιο σωστά ως ανοσοκηλίδα. Επομένως, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ immunoblot και western blot ως προς την αρχή, τη μεθοδολογία ή τις εφαρμογές.

Βασικά, στο western blot, οι πρωτεΐνες υφίστανται μετουσίωση και διαχωρισμό μεγέθους με ηλεκτροφόρηση γέλης. Στη συνέχεια, οι διαχωρισμένες πρωτεϊνικές ζώνες μεταφέρονται σε μια μεμβράνη φορέα όπως νιτροκυτταρίνη ή PVDF σε μια διαδικασία γνωστή ως στύπωμα. Τελικά, αντισώματα συζευγμένα με φθορίζουσες, ραδιενεργές ετικέτες ή ένζυμα αναφοράς συμμετέχουν στην αναγνώριση συγκεκριμένων πρωτεϊνών στη μεμβράνη.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι η ανοσοκηλίδα
    – Σύντομη περιγραφή
2. Τι είναι η Μεθοδολογία του ανοσοστυπώματος
    – Ίση φόρτιση πρωτεϊνών, διαχωρισμός πρωτεϊνών, ηλεκτροφορητική μεταφορά, ανίχνευση αντισωμάτων
3. Ποιες είναι οι εφαρμογές του Immunoblot
    – Στη Βιοχημεία, στην Κλινική Εφαρμογή
4. Τι είναι το Western Blot
    – Σύντομη περιγραφή

Βασικοί όροι 

Ανίχνευση πρωτεϊνών, ανοσοκηλίδωση, πρωτογενή αντισώματα, δευτερογενή αντισώματα, στύπωμα Western  

Τι είναι το Immunoblot 

Η ανοσοστύπωση είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική στη μοριακή βιολογία καθώς και στην ανοσογενετική για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε ένα δείγμα. Γενικά, αυτή η τεχνική ονομάζεται πιο συγκεκριμένα ως «ανοσοκηλίδωση» λόγω της χρήσης του anti για την ανίχνευση πρωτεϊνών.

Εικόνα 1:Ανοσοκηλίδωση

Επιπλέον, το εργαστήριο του Χάρι Τάουμπιν στο Ινστιτούτο Φρίντριχ Μίσερ στη Βασιλεία της Ελβετίας ανέπτυξε τη μέθοδο. Εδώ, οι αρχές της ανοσοστύπωσης περιλαμβάνουν ίση φόρτωση πρωτεϊνών, διαχωρισμό πρωτεϊνών κατά μοριακό βάρος, ηλεκτροφορητική μεταφορά πρωτεϊνών σε κατάλληλη μεμβράνη και ανίχνευση αντισωμάτων.

Μεθοδολογία ανοσοστύπωσης

Ίση φόρτωση πρωτεϊνών 

Συνήθως, είναι σημαντικό να έχουμε ίση συγκέντρωση πρωτεϊνών ανά δείγμα στην ανοσοκηλίδα. Βασικά, τα τρία συστατικά κάθε δείγματος είναι το εκχύλισμα πρωτεΐνης, το ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης και το ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Εδώ, το ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης είναι σημαντικό για την κανονικοποίηση του εκχυλίσματος πρωτεΐνης στην επιθυμητή συγκέντρωση πρωτεΐνης. Επιπλέον, το ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος ή το ρυθμιστικό διάλυμα Laemmli είναι μοναδικό για την προετοιμασία δειγμάτων ανοσοκηλιδώσεως. Περιέχει αντιδραστήρια, τα οποία παίζουν μια λειτουργία στο SDS-PAGE. Επίσης, περιέχει Tris-HCl pH 6,80 γλυκερόλη, SDS, βήτα-μερκαπτοαιθανόλη και μπλε βρωμοφαινόλης.

Το Tris-HCl pH 6,80 λειτουργεί σε σύζευξη με το ασυνεχές buffer σύστημα. Επίσης, η γλυκερίνη προσθέτει πυκνότητα στο δείγμα κατά τη φόρτωση. Εκτός από αυτά, το SDS είναι ένα ισχυρό ιοντικό απορρυπαντικό, που επικαλύπτει μετουσιωμένες πρωτεΐνες με ίση αναλογία ανιόντων προς μάζα. Έτσι, αυτό καλύπτει το φορτίο, το μέγεθος και το σχήμα της πρωτεΐνης, επιτρέποντας τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε συνάρτηση με το μοριακό της βάρος. Εν τω μεταξύ, η βήτα-μερκαπτοαιθανόλη μειώνει τους δισουλφιδικούς δεσμούς, οι οποίοι διατηρούν το σχήμα της πρωτεΐνης σε κάποιο βαθμό. Περαιτέρω, το μπλε της βρωμοφαινόλης χρησιμεύει ως το μέτωπο βαφής κατά την ηλεκτροφόρηση γέλης.

Διαχωρισμός πρωτεϊνών ανά μοριακό βάρος 

Στη συνέχεια των παραπάνω, το SDS-PAGE επιτρέπει τον διαχωρισμό του δείγματος κατά μοριακό βάρος με τη βοήθεια του απορρυπαντικού και του ασυνεχούς ρυθμιστικού συστήματος. Γενικά, το δείγμα μετουσιώνεται με θερμότητα πριν από τη φόρτωση στο πήκτωμα, εξασφαλίζοντας τον διαχωρισμό μέσω μονομερούς μοριακού βάρους. Επίσης, το απορρυπαντικό στο SDS-PAGE είναι SDS.

Εικόνα 2:SDS-PAGE

Επιπλέον, το ασυνεχές σύστημα buffer περιλαμβάνει δύο buffer. ρυθμιστή λειτουργίας και τον προσκρουστήρα ηλεκτροδίου.

Ηλεκτροφορητική μεταφορά 

Κανονικά, πολλές μέθοδοι αποτύπωσης περιλαμβάνουν την ηλεκτροφορητική μεταφορά πρωτεϊνών σε διαφορετικές μεμβράνες. Ωστόσο, η αρχή τους είναι παρόμοια, η οποία είναι η μετανάστευση των αρνητικά φορτισμένων δειγμάτων προς την άνοδο.

Εικόνα 3:Ηλεκτροφορητική μεταφορά

Σε αυτή τη διαδικασία, η νιτροκυτταρίνη ήταν το χρυσό πρότυπο ως μεμβράνη μέχρι την εμφάνιση των μεμβρανών PVDF. Είναι σημαντικό ότι αυτές οι μεμβράνες έχουν υψηλότερη ικανότητα δέσμευσης πρωτεΐνης σε σχέση με την πρώτη.

Ανίχνευση αντισωμάτων 

Τελικά, δύο τύποι αντισωμάτων συμμετέχουν στην ανίχνευση και την ανάλυση. Είναι πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα. Τώρα, οι πρωτεΐνες βρίσκονται στη μεμβράνη. Επομένως, τα πρωτογενή αντισώματα συνδέονται άμεσα με τις συγκεκριμένες περιοχές πρωτεϊνών στη μεμβράνη. Εν τω μεταξύ, τα δευτερεύοντα αντισώματα συνδέονται έμμεσα με συγκεκριμένες πρωτεΐνες μέσω πρωτογενών αντισωμάτων. Είναι σημαντικό ότι ο αποκλεισμός είναι η διαδικασία, η οποία επικαλύπτει την υπόλοιπη επιφάνεια στη μεμβράνη πριν από την ανίχνευση αντισωμάτων. Έτσι, αυτό μειώνει το φόντο, εξαλείφοντας τα ψευδώς θετικά. Επίσης, το ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού περιέχει είτε καζεΐνη είτε αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). όλα έχουν χαμηλή συγγένεια με τις πρωτεΐνες του δείγματος. Επιπλέον, τα βήματα πλύσης μετά την επώαση της μεμβράνης με καθένα από τους δύο τύπους αντισωμάτων είναι επίσης σημαντικά για τη μείωση του υποβάθρου.

Εικόνα 4:Ανίχνευση αντισωμάτων

Επιπλέον, τα δευτερεύοντα αντισώματα συνήθως συζευγνύονται με ένα συγκεκριμένο συστατικό για την ανάλυση. Εδώ, αυτό το συστατικό μπορεί να είναι είτε ένα ραδιενεργό ισότοπο, είτε ένα φθοροφόρο ή πιο συχνά ένα ένζυμο αναφοράς, όπως η υπεροξειδάση χρένου (HRP) ή η αλκαλική φωσφατάση (AP). Είναι σημαντικό ότι η χρήση ενζύμων στην ανάλυση στη μέθοδο της χημειοφωταύγειας επιτρέπει την ανίχνευση των δεσμευμένων αντισωμάτων στη μεμβράνη μέσω χρωματομετρικής ανάλυσης.

Εικόνα 5:Ανίχνευση χημειοφωταύγειας

Τέλος, η απεικόνιση ζωνών στη μεμβράνη επαληθεύει την παρουσία των συγκεκριμένων πρωτεϊνών στα χρησιμοποιούμενα πρωτεύοντα αντισώματα.

Εφαρμογές 

Τυπικά, στη βιοχημεία, η ανοσοστύπωση είναι εξαιρετικά σημαντική για την ποιοτική ανίχνευση μιας μεμονωμένης πρωτεΐνης ή μιας τροποποίησης πρωτεΐνης. Επίσης, το μέγεθος και η χρωματική ένταση της ταινίας παρέχουν μια ημι-ποιοτική ανάλυση. Επομένως, η ανοσοστύπωση είναι σημαντική για την επαλήθευση της παραγωγής πρωτεΐνης μετά την κλωνοποίηση.

Κλινικά, η ανοσοκηλίδα παίζει βασικό ρόλο στην ανίχνευση αντισωμάτων κατά του HIV στον ορό και τα ούρα. Συνήθως, είναι σημαντικό να επιβεβαιωθεί η διάγνωση του HIV μετά από μια εξέταση ELISA, η οποία μπορεί να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Επίσης, είναι σημαντικό για την ανίχνευση της παραλλαγής της νόσου Creutzfeldt-Jakob, της σπογγώδους εγκεφαλοπάθειας των βοοειδών ή της νόσου των τρελών αγελάδων, της νόσου του Lyme, κ.λπ. 

Τι είναι το Western Blot 

Το "Western blot" είναι ένα άλλο όνομα για το immunoblot, το οποίο ανιχνεύει συγκεκριμένες πρωτεΐνες σε ένα δείγμα. Ωστόσο, ο όρος "western blot" επινοήθηκε από τον W. Neal Burnette το 1981 μετά το επώνυμο νότιο στύπωμα για το DNA. Εν τω μεταξύ, η κηλίδα Southern αναπτύχθηκε από τον Βρετανό βιολόγο Έντουιν Σάουθουρ για να ανιχνεύσει συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA σε μια κηλίδα μεμβράνης. Επίσης, το «northern blot» είναι η τεχνική για την ανίχνευση του RNA που αναπτύχθηκε το 1977 από τους James Alwine, David Kemp και George Stark στο Stanford University, με τη συμβολή του Gerhard Heinrich.

Διαφορά μεταξύ Immunoblot και Western Blot 

• Δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ immunoblot και western blot. Ωστόσο, το ανοσοστύπωμα είναι το πιο σωστό όνομα για την τεχνική λόγω της χρήσης αντισωμάτων για την ανίχνευση πρωτεϊνών στο δείγμα.

Συμπέρασμα 

Η ανοσοστύπωση είναι η τεχνική στη μοριακή βιολογία για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών στο δείγμα με τη χρήση αντισωμάτων. Έτσι, λόγω της χρήσης αντισωμάτων για τον σκοπό ανίχνευσης, το πιο σωστό όνομα για την τεχνική είναι ανοσοστύπωμα. Ωστόσο, είναι επίσης γνωστό ως «κηλίδα Western» για να αντιπροσωπεύει την αντίθετη τεχνική, η οποία είναι η κηλίδα Southern, ανιχνεύοντας συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA στο στύπωμα. Όσον αφορά τη διαδικασία, η ανοσοστύπωση περιλαμβάνει τον διαχωρισμό μεγέθους μετουσιωμένων πρωτεϊνών σε ένα πήκτωμα που ακολουθείται από μεταφορά των προκύπτων θραυσμάτων σε μια μεμβράνη. Τέλος, τα επισημασμένα αντισώματα συνδέονται με τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες στη μεμβράνη. Επομένως, με βάση αυτόν τον απολογισμό, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ του ανοσοστυπώματος και του στυπώματος western όσον αφορά την αρχή, τη μεθοδολογία ή τις εφαρμογές.

Αναφορές:

1. Gavini K, Parameshwaran K. Western Blot (Protein Immunoblot) [Ενημερώθηκε 7 Ιουνίου 2019]. Στο:StatPearls [Διαδίκτυο]. Treasure Island (FL):StatPearls Publishing; Ιανουάριος 2019-. Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "Anti-lipoic acid immunoblot" Από TimVickers – Δική μου εργασία (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia   
2. "SDS-PAGE Electrophoresis" By Bensaccount στην Αγγλική Wikipedia (CC BY 3.0) μέσω Commons Wikimedia   
3. "Μεταφορά Western blot" Από τον Bensaccount στην Αγγλική Wikipedia (CC BY 3.0) μέσω του Commons Wikimedia    
4. "Western Blot binding" Από τον Bensaccount στην Αγγλική Wikipedia (CC BY 3.0) μέσω του Commons Wikimedia   
5. "Western blot chemiluminescent detection" By Bensaccount στην αγγλική Wikipedia (CC BY 3.0) μέσω του Commons Wikimedia