Μια τεχνική για την πρόβλεψη πώς να αναπτυχθούν καλύτερα σπάνια, απειλούμενα και ανυπόφορα φυτά
Πολλοί άνθρωποι έχουν ακούσει για δύο φαινομενικά ανόμοιες έννοιες:ανθεκτικά (ή δύσκολο να αναπτυχθούν) φυτά και υγρή χρωματογραφία. Η καλλιέργεια φυτικού ιστού ή η in vitro καλλιέργεια είναι μια πολύτιμη τεχνική που επιτρέπει την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και τον χειρισμό των φυτών σε στείρες και ελεγχόμενες συνθήκες καλλιέργειας και η οποία απαιτεί μόνο πολύ λίγο υλικό έναρξης. Τα φυτά αναπτύσσονται σε μέσο ανάπτυξης, συνήθως με βάση το άγαρ, και συμπληρώνονται με άνθρακα, μικρο- και μακρο-θρεπτικά συστατικά για την προώθηση και την υποστήριξη της ανάπτυξης.
Το μέσο στο οποίο καλλιεργούνται συχνά συμπληρώνεται με διάφορες χημικές ουσίες που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των φυτών, που ονομάζονται ρυθμιστές ανάπτυξης φυτών ή φυτοορμόνες, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να κατευθύνουν τα φυτά προς συγκεκριμένα μοτίβα ανάπτυξης. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες κατηγορίες είναι οι αυξίνες, το πρώτο PGR που ανακαλύφθηκε και οι κυτοκινίνες. Η ισορροπία αυτών των δύο ρυθμιστών προσδιορίστηκε ότι είναι καθοριστική για την κατεύθυνση της ανάπτυξης των φυτών και περιγράφηκε από τους Skoog και Miller σε καλλιέργειες φύλλων καπνού το 1957. Με απλά λόγια, η υψηλή αυξίνη και η χαμηλή κυτοκινίνη οδηγούν στην παραγωγή ριζών. χαμηλή αυξίνη και υψηλή κυτοκινίνη για παραγωγή βλαστών. Και η ισορροπία των δύο οδηγεί στην παραγωγή μιας μάζας αδιαφοροποίητων κυττάρων, ενός τύπου ιστού που αναφέρεται ως κάλος.
Η καλλιέργεια φυτικών ιστών βασίζεται στην έννοια της ολοδύναμης, δηλαδή το φαινόμενο κατά το οποίο κάθε μεμονωμένο φυτικό κύτταρο έχει την ικανότητα να αποδιαφοροποιείται και να επαναδιαφοροποιείται σε οποιοδήποτε άλλο τύπο κυττάρων και τελικά σε ολόκληρα φυτά. Για το λόγο αυτό, χιλιάδες ή και εκατομμύρια φυτά μπορούν να πολλαπλασιαστούν από ένα μόνο φύλλο από ένα μητρικό φυτό, που θεωρείται εκφύτεμα. Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους πολλαπλασιασμού που μπορεί να απαιτούν τη λήψη μεγάλου κλαδιού ή μοσχευμάτων ρίζας, αυτό καθιστά την καλλιέργεια ιστών ελκυστική τεχνική για τον πολλαπλασιασμό φυτών για τα οποία υπάρχει περιορισμένο υλικό. Τα απειλούμενα φυτά είναι μια τέτοια ομάδα, καθώς η παραγωγή περισσότερων από αυτά τα φυτά είναι προφανώς επιθυμητή, ωστόσο, οι πληθυσμοί έχουν μειωθεί σε μικρούς αριθμούς με μερικούς να αντιπροσωπεύονται ακόμη και από ένα μόνο άτομο, καθιστώντας τη συλλογή μεγάλων ποσοτήτων ιστών αδύνατη, ιδιαίτερα για μικρότερα άτομα.
Δυστυχώς, δεν τηρούν όλα τα φυτά τις αρχές που καθιέρωσαν αρχικά οι Skoog και Miller, και τα δυσανάλογα φαρμακευτικά και απειλούμενα φυτά, τείνουν να μην ακολουθούν εύκολα αυτές τις αρχές σε σύγκριση με άλλα είδη. Αν και ίσως απροσδόκητο με την πρώτη ματιά, αυτό είναι λογικό καθώς αυτά τα είδη έχουν συχνά εξειδικευμένα χαρακτηριστικά ή απαιτήσεις ανάπτυξης που τα οδηγούν στο να κινδυνεύουν με εξαφάνιση ή/και να είναι ιατρικά αρχικά. Οι συμβατικές μέθοδοι χρησιμοποιούν μια προσέγγιση για την επίλυση αυτού του προβλήματος, η οποία περιλαμβάνει την προσπάθεια ανάπτυξης των μοσχευμάτων σε διάφορους συνδυασμούς μικρο- και μακρο-θρεπτικών συστατικών σε συνδυασμό με συνδυασμούς διαφορετικών κατηγοριών ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών, οι κυριότεροι από τους οποίους είναι:αυξίνες, κυτοκινίνες, γιβερελλίνες, γιασμονικά, και σαλικυλικά.
Τα εργαστήρια μπορούν επίσης να χρησιμοποιούν διάφορους αναστολείς σε μια προσπάθεια να τροποποιήσουν τα ενδογενή επίπεδα αυτών των ορμονών στον ιστό καθώς φυτά που έχουν φυσικά ήδη υψηλά επίπεδα αυξίνης, για παράδειγμα, μπορεί να είναι πιο ανθεκτικά στην παραγωγή βλαστών ή μπορεί να είναι πιο ευαίσθητα στην προσθήκη συμπληρωματικής αυξίνης. Η πολυπλοκότητα της χημείας των φυτών σημαίνει ότι αυτή μπορεί να είναι μια χρονοβόρα και τελικά δαπανηρή άκαρπη προσπάθεια, με τους ερευνητές ουσιαστικά να μαντεύουν τι μπορεί να ξεπεράσει την ανυπαρξία.
Σημαίνει κυριολεκτικά έγχρωμη («chrom») γραφή («γραφική παράσταση») η εμπειρία του μέσου ατόμου με τη χρωματογραφία μπορεί να επεκταθεί μόνο σε απλά πειράματα που συναντώνται στο δημοτικό σχολείο, όπου ένας μαύρος μαρκαδόρος διαχωρίζεται για να δει το ουράνιο τόξο των χρωμάτων που περιλαμβάνει αυτό το μελάνι σε ένα φίλτρο καφέ , ή σε μια παροδική αναφορά σε δημοφιλείς εκπομπές διερεύνησης εγκλημάτων όπως το CSI ή τα εγκληματολογικά αρχεία. Η τεχνική, ωστόσο, χρησιμοποιείται σε ερευνητικά και εμπορικά εργαστήρια για δεκαετίες, και παρόλο που συνδέεται συχνότερα με χημικούς, η τεχνική ορίστηκε για πρώτη φορά από τον βοτανολόγο Mikhail Tsvet στα τέλη του 1800 με στόχο τον διαχωρισμό των φυτικών φωτοσυνθετικών χρωστικών:ξανθοφύλλες (κίτρινο), καροτενοειδή (πορτοκαλί) και χλωροφύλλη (πράσινη). Αυτή η τεχνική περιλαμβάνει τον διαχωρισμό των ενώσεων από ένα μείγμα σε μια στήλη που είναι γενικά γεμάτη με πυρίτιο και διαχωρισμένες ενώσεις και στη συνέχεια εισέρχονται σε έναν ανιχνευτή που είναι ικανός να μετρήσει και να αναγνωρίσει αυτές τις ενώσεις.
Πολλαπλασιαζόμενα Ανυπόφορα Φυτά
Στην πρόσφατη μελέτη μας, συγκεντρώσαμε αυτές τις δύο έννοιες για να προτείνουμε μια νέα προσέγγιση στο πρόβλημα του πολλαπλασιασμού των ανθεκτικών φυτών, ποσοτικοποιώντας πρώτα τα επίπεδα ενδογενών ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών και χρησιμοποιώντας αυτό ως σημείο εκκίνησης για προσπάθειες πολλαπλασιασμού. Για να γίνει αυτό, έχουμε αναπτύξει μια απλή, αποτελεσματική και χαμηλού κόστους μέθοδο για την ανάλυση αυτών των ενώσεων. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί σχετικά φθηνά όργανα, απορρίπτονται εύκολα από διαλύτες και δεν απαιτεί εκτεταμένο υπόβαθρο χημείας, τα οποία αποτελούν όλα σημαντικά εμπόδια για τα εργαστήρια καλλιέργειας ιστών φυτών που ενδέχεται να επιθυμούν να εφαρμόσουν αυτές τις τεχνολογίες.
Οι φυτικοί ιστοί καταψύχονται αρχικά, αλέθονται και εκχυλίζονται σε 50% οξινισμένη μεθανόλη και εκχυλίζονται μέσω υπερήχων. Αφού φιλτραριστούν και αραιωθούν τα δείγματα είναι έτοιμα για ανάλυση. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί υγρή χρωματογραφία με ανίχνευση με φασματομετρία μάζας για να ποσοτικοποιήσει σε ένα μόνο 5 λεπτά οκτώ κύριους ρυθμιστές ανάπτυξης φυτών, συμπεριλαμβανομένων τριών κυτοκινινών - ζεατίνη, βενζυλαμινοπουρίνη (BA), 6-(γ, γ-διμεθυλαλλυλαμινο)πουρίνη (2-iP), αυξίνη (ινδολο-3-οξικό οξύ, ΙΑΑ), γιββερελικό οξύ (GA3), αψισικό οξύ (ΑΒΑ), γιασμαμονικό οξύ (JA) και σαλικυλικό οξύ (SA), καθώς και ο πρόδρομος του JA:12-οξοφυτοδιενοϊκό οξύ ( OPDA) και τη δραστική μορφή του JA:ισολευκίνη του γιασμαμονικού οξέος (JA-Ile) καθώς και του παραγώγου σαλικυλικού οξέος ακετυλοσαλικυλικό οξύ (ASA), κοινώς γνωστό ως ασπιρίνη. Στη συνέχεια, τα δείγματα διαχωρίζονται με υγρή χρωματογραφία χρησιμοποιώντας μια μέθοδο βαθμίδωσης με συστατικά κινητής φάσης:10 mM οξικό αμμώνιο, pH 9,0 και 100% μεθανόλη.
Οι αναλύτες ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας καταγραφή ενός ιόντος που επιτρέπει βελτιωμένη εκλεκτικότητα και καλή ευαισθησία. Αυτή η μέθοδος επικυρώθηκε μέσω επαναλαμβανόμενων ενέσεων για πολλές ημέρες και παρασκευασμάτων εκχυλισμάτων και σε οκτώ είδη φυτών που περιελάμβαναν φαρμακευτικά φυτά (γλυκιά αψιθιά, μάραθο και υπερικό), εμπορικά είδη (πατάτα και μπανάνα), καλλωπιστικά (αφρικανική βιολέτα) και δέντρα (Αμερικανική φτελιά) και τρεις τύπους ιστών (βλαστός, ρίζα και σπόρος). Διαπιστώθηκε ότι έχει εξαιρετική ακρίβεια, ακρίβεια και αναπαραγωγιμότητα, καθιστώντας την μια μέθοδο που θα έπρεπε να είναι εύκολη η αναπαραγωγή σε άλλα εργαστήρια.
Επιπλέον, η συμπερίληψη των τριών παραγώγων ενώσεων (JA-Ile, OPDA και ASA) καταδεικνύει ότι εκτός από το ότι είναι χρήσιμο στη μέτρηση των ενώσεων που περιλαμβάνονται ήδη στη μέθοδο, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως σημείο εκκίνησης για την προσθήκη περαιτέρω σχετικών ενώσεις, σε εργαστήρια για τα οποία η μέθοδος δεν είναι ήδη ολοκληρωμένη.
Αυτή η μέθοδος, επομένως, παρέχει την τεχνική μέθοδο που απαιτείται για μια νέα προσέγγιση για την αντιμετώπιση της ανυπαρξίας σε διάφορα είδη φυτών, η οποία δεν απαιτεί ακριβά ή ιδιαίτερα επικίνδυνα χημικά και η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε εργαστήρια με μια σειρά από τεχνική εμπειρία.
Αυτά τα ευρήματα περιγράφονται στο άρθρο με τίτλο Μια απλή και αποτελεσματική μέθοδος για την ανάλυση των ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών:ένα νέο εργαλείο στο στήθος για την καταπολέμηση της ανυπομονησίας στην καλλιέργεια φυτικών ιστών, που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Plant Cell, Tissue and Organ Culture . Επικεφαλής αυτής της εργασίας ήταν οι Lauren A E Erland &Praveen K Saxena από το Πανεπιστήμιο του Guelph.
